如何制備流式細胞儀標本？

發布時間:2017-11-21 14:41 | 編輯:流式細胞儀 | 138 次瀏覽
活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。這就是流式細胞儀標本制備的原理。流式細胞儀標本的制備具體步驟：1、收集細胞。上皮細胞需要蛋白酶消化，然后收集。加PBS或者流式洗液1ml，振蕩，1400rpm離心5min，棄上清。2、染表型懸浮細胞于100ul體積，細胞濃度約為或者小于1X10^6，加...

活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。這就是流式細胞儀標本制備的原理。

流式細胞儀標本的制備具體步驟：

1、收集細胞。上皮細胞需要蛋白酶消化，然后收集。加PBS或者流式洗液1ml，振蕩，1400rpm離心5min，棄上清。

2、染表型懸浮細胞于100ul體積，細胞濃度約為或者小于1X10^6，加入流式染色抗體。按照說明書用量或者減半（根據經驗），分出一管作為同型。

3、4℃，避光30min，用PBS洗一遍，1400rpm離心5min，棄上清。

4、破膜破膜劑以BDpharmingen破膜劑為例，加300ul，4℃，避光30min以現配的破膜洗液1ml洗一遍。1400rpm離心5min，棄上清。

5、胞內染色加入流式抗體4℃，避光30min。用破膜洗液1ml洗一遍，1400rpm離心5min，棄上清。

6、加入200ul1～2％多聚甲醛4℃避光保存。一般情況下，可直接把抗體加入到棄上清后的殘留液里（體積大概為50ul左右）。

流式細胞儀標本制備注意事項：

1、整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaNO3，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發生交聯、脫落；

2、洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陰性；

3、加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

4、細胞活性要好，否則易發生非特異性熒光染色。

以上就是流式細胞儀使用的相關事項，希望文章對大家有幫助！

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